Existe un grupo de enfermedades conocidas como ETAS (enfermedades transmitidas por alimentos). Entre ellas se encuentran las transmitidas por el agua. Es entonces conveniente determinar la potabilidad desde el punto de vista bacteriológico de este medio. Buscar gérmenes como Salmonella, Shigella, trae inconvenientes, pues normalmente aparecen en escasa cantidad. Por otra parte su supervivencia en este medio desfavorable y la carencia de métodos sencillos y rápidos, llevan a que su investigación no sea satisfactoria, máxime cuando se hallen en número reducido.En vista de estos inconvenientes se ha buscado un método mas seguro para establecer la calidad higiénica de las aguas, método que se basa en la investigación de bacterias coliformes como indicadores de contaminación fecal.El agua que contenga bacterias de ese grupo se considera potencialmente peligrosa, pues en cualquier momento puede llegar a vehiculizar bacterias patógenas, provenientes de portadores sanos, individuos enfermos o animales.
Limites permisibles para aguas de consumo
1. Bacterias mesófilas viables: en agar Plate Count 24 hs. a 37ºC, no mas de 500 UFC/ml
2. Bacterias coliformes: NMP a 37ºC – 48 hs. (Caldo Mc Conckey o Lauril Sulfato), en 100 ml; igual o menor a 3.
3. Ausencia de Escherichia coli: en 100 ml
4. Ausencia de Pseudomona aeruginosa: por 100 ml de muestraDeterminación del número de bacterias aerobias mesófilas por el Método de recuento en placa.
Generalidades:
El agua contiene bacterias cuyas necesidades nutritivas y de temperatura óptima de desarrollo son variables.Ordinariamente esta determinación se efectúa sembrando en medio sólido un volumen conocido de la muestra de agua. Se incuba durante un tiempo y a determinadas temperaturas y se cuenta el número de colonias que se obtienen.El medio utilizado es agar nutritivo o agar Plate Count (aproximadamente 15 ml por placa).
· Diluyentes:
Es importante usar un líquido de dilución desprovisto de acción bactericida. En la mayoría de los casos puede utilizarse agua corriente, agua destilada o solución fisiológica o agua peptonada 0,1 % con pH ajustado a 7.
· Preparación de las diluciones:
Se preparan tubos estériles con 9 ml de diluyente. Para hacer las diluciones se agita, repetidas veces, la muestra. Luego se flamea la boca del frasco, se destapa, se vuelca un poco de contenido y, tapado nuevamente, se agita 10 – 15 veces para asegurar la distribución uniforme de las bacterias del líquido.Luego mediante una pipeta esterilizada, se toma 1 ml de muestra que se pasa a un tubo con 9 ml de diluyente. Se tiene así la muestra diluida 10 veces. Se agita esta aspirando y expeliendo el liquido de la pipeta repetidas veces, y luego, mediante otra pipeta esterilizada, se toma 1 ml del liquido diluido, el cual se pasa a un nuevo tubo con solución diluyente, esta operación se repite hasta que se estime conveniente. Según la naturaleza del agua se sembrará directamente o diluida. Las muestras de aguas superficiales purificadas o profundas se sembraran directamente y diluidas 1/10, para las aguas superficiales no purificadas se emplearan diluciones 1/10, 1/100, 1/1000.
Incubación:
Luego se incuban las muestras a 32 – 35 ºC durante 24 horas. Se realiza la siembra en profundidad.Recuento de colonias en placas:· Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias. · Tomar la media aritmética de los 2 recuentos y multiplicar por el factor de dilución (recíproco de la dilución utilizada). Informar según el caso, el resultado como número de microorganismos aerobios mesófilos por ml ó gramo . En la evaluación de la potabilidad del agua ubicada en reservorios de almacenamiento domiciliario deberá incluirse entre los parámetros microbiológicos a controlar el recuento de bacterias mesófilas en agar (APC – 24 hs. a 37º C); en el caso de que el recuento supere las 500 UFC/ml y se cumplan el resto de los parámetros indicados, sólo se deberá exigir la higienización del reservorio y un nuevo recuento.
2. Determinación del Número Más Probable(NMP) / 100 ml de bacterias de coliformes totales (Método de Wilson)
Bacterias coliformes:Son bacterias aerobias o anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas.
Exámenes para determinar organismos patógenos
Si bien la búsqueda directa de bacterias patógenas específicas no forma parte de los exámenes bacteriológicos habituales a los que se someten las muestras de agua, habrá casos en que será necesario efectuar exámenes para la determinación de gérmenes patógenos intestinales; por ejemplo, durante una epidemia o cuando se está evaluando una nueva fuente. Las posibilidades de obtener buenos resultados serán entonces mayores si se analizan volúmenes grandes de agua y si se usan medios selectivos para determinados gérmenes patógenos intestinales. Los análisis incluirán algunas, sino todas, de las etapas siguientes: concentración de los microorganismos en la muestra, inoculación en un caldo de abono; subcultivos en medios de agar selectivos, y análisis bioquímicos y serológicos de las colonias sospechosas. En vez de basarse en un método único, conviene utilizar el mayor número posible de métodos a fin de que no se pierda ninguna oportunidad de detectar a un germen patógeno. Esto es especialmente válido para la detección de Salmonella, puesto que no existe un solo método que se adapte a todos los serotipos.
Concentración de las muestras
La técnica que se emplee dependerá en gran parte de la cantidad de partículas presentes en el agua. En las aguas de baja turbiedad, la muestra puede pasarse a través de filtros de membrana. Debido a que la turbiedad aumenta en las aguas naturales, se puede recurrir a la filtración a través de tierras diatomáceas o con filtros de cartucho o vela, con lo cual se incrementará la filtración y podrán tratarse volúmenes de muestras más grandes. Como alternativa, se puede utilizar la técnica de la almohadilla de gasa, especialmente cuando el número de gérmenes patógenos son pocos o su presencia no es permanente.
Salmonella
Es probable que los concentrados de muestras necesiten ser enriquecidos previamente en agua de peptona amortiguada, para luego ser enriquecidos en caldo que contenga ya sea tetrationato, selenito, cloruro de magnesio o verde de malaquita. Estos, a su vez, pueden ser sometidos a subcultivo en medios como el verde brillante, sulfito de bismuto, agar de desoxicolata xilosa-lisina (DXL), citrato de desoxicolata o agar de MacConkey, examinándose luego las colonias sospechosas tanto bioquímica como serológicamente. Entre las pruebas de depuración bioquímica se deberá incluir: agar triple de azúcar y hierro, producción de indol, decarbosilasa y actividad de ß-galactosidasa. En las pruebas serológicas se incluirá la aglutinación con sueros polivalentes anti-o, anti-H y anti-Vi. Es imprescindible la eliminación previa de cepas autoaglutinables. Cuando el análisis se realiza para detectar las S. typhi , el medio de cultivo aconsejado es la selenita F. El procedimiento de los tubos múltiples se utilizará para calcular el número de Salmonella presentes en el agua.
Shigella
Debido a que las bacterias coliformes y la mayoría de cepas de Proteus vulgaris son antagónicas a la Shigella, es aconsejable elegir medios enriquecidos selectivos que reduzcan al mínimo las acumulaciones de compuestos volátiles y de los subproductos obtenidos a partir de estos microorganismos antagónicos. Se puede usar caldo nutriente con un pH ajustado de 8,0 (es el nivel de pH que menos favorece el crecimiento de bacterias coliformes). También es posible obtener un buen enriquecimiento de Shigella con un medio de cultivo autocitotóxico con base en caldo de tripticasa de soja conteniendo 1 mmol/litro de 4-cloro- 2-ciclopentilfenil ß-D-galactopiranosida, 2,5 g/litro de lactosa y sustancia amortiguadora de citrato a un pH de 6,2. La incubación debe hacerse durante 6-18 horas, a una temperatura de 35°C. Estríense las culturas en agar DXL cuando hayan transcurrido 6 y 18 horas. Sométanse las colonias sospechosas a pruebas de selección bioquímica y confírmese las colonias sospechosas con antisueros de Shigella (sueros polivalentes y de tipo específico).
Vibriones del cólera y de otro tipo
Como forma de enriquecimiento primario se utiliza principalmente el agua alcalina de peptona y el agua de taurocolato telurita de peptona, los subcultivos se harán utilizando como medios selectivos un agar de tiosulfato, citrato, bilis, sal y sucrosa o un agar de gelatina de taurocolato y telurito. Los cultivos que sean sospechosos se inocularán en agar de hierro Kligler. Después de 18 horas de incubación, los V. cholerae producen un característico color amarillo, sin ninguna producción de gas. Estos cultivos se depurarán después para determinar la actividad de ureasa y oxidasa; las cepas que demuestren ser negativas respecto a úrea y positivas en cuanto a oxidasa deberán ser remitidas a un laboratorio de referencia para que se realicen otras pruebas bioquímicas y de agrupamiento serológico.
Coli enteropatógenos
En este caso se utilizan las técnicas para la detección de bacterias coliformes fecales en el agua. Las colonias se confirmarán como E. coli y si la evidencia epidemiológica así lo garantiza, los subcultivos pueden ser remitidos a un laboratorio de referencia para agrupamiento serológico y, en caso necesario, para realizar las pruebas que determinan la enterotoxigenicidad.
Yersinia enterocolitica
Se ha encontrado que el agar M-Endo es el medio de cultivo más conveniente y de múltiple utilidad debido a las distintas características morfológicas de las colonias cuando se incuban tanto a 25 como a 35°C. Después de transcurridas 72 horas de incubación, las colonias aparecerán bien definidas y con una coloración roja oscura. También da buenos resultados para el desarrollo bacteriano utilizar agar de MacConkey, siempre que la incubación se haga a 25°C. Todos los grupos aislados que resulten sospechosos deberán ser depurados bioquímicamente a 25°C y 35°C utilizando ramnosa, rafinosa y melibiosa. Si existe evidencia epidemiológica que lo garantice, deberán enviarse los subcultivos a un laboratorio de referencia para formar los grupos serológicos y efectuar las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos.
Campylobacter fetus
Existe una técnica de membrana filtrante que ha dado buenos resultados para aislar este germen patógeno, y en la cual se emplea un agar sanguíneo que contiene vancomicín, polimixin y trimetoprim. Los cultivos se incuban a 42-43°C, bajo tensión reducida de oxígeno, en una jarra anaeróbica durante 3 días e inspeccionadas diariamente para detectar las colonias mucoideas grises no hemolíticas (con diámetro de 1-2 mm). Las colonias sospechosas son teñidas con Gram para detectar las formas típicamente curvas y en S, y sometidas a prueba para determinar la reacción positiva a la oxidasa y la catalasa, la motilidad y la incapacidad para desarrollarse aeróbicamente a una temperatura de 36°C. Los subcultivos deben ser remitidos a un laboratorio de referencia para mayores pruebas de tipo bioquímico. No sería práctico que los elementos aislados de brotes esporádicos fueran serotipificados, debido a la heterogeneidad de este organismo; por ahora, tampoco resulta práctico el uso de un antígeno común o de un conjunto de serotipos diferenciales.
Análisis Bacteriológicos.
Análisis Físico Químicos.
Análisis Legionella.
